試劑：CleanAmp™ PCR Kit

儀器：Mastercycler® ep realplex4 S qPCR instrument

分子診斷需求的不斷增長（如新,冠,核,酸檢測），要求所用檢測試劑、設備能在更短的時間內提供準確的、可重復的檢測結果。這種需求下，多重實時PCR（Multiplex qPCR）是一項很有用的技術，可省時、省力、省樣本，還能降低成本。然而盡管多重qPCR檢測技術有著諸多優點，但實際應用時卻需要進行很多的優化來避免由于引物組增加而造成的擴增效率下降的問題。Trilink的CleanAmp™ dNTP試劑完,美的解決了這一問題，本文展示了使用Trilink的CleanAmp™ dNTP試劑和靈敏的qPCR儀器實現快速三重qPCR的案例。

CleanAmp™ dNTP是Trilink運用自己專業的核酸修飾技術開發的專,利產品。

PCR的熱啟動，通常要通過使用熱啟動酶來實現。而在PCR實驗中，簡單的將標準dNTP替換為CleanAmp™ dNTP，即可獲得與使用昂貴的熱啟動酶相同的優勢。CleanAmp™ dNTP是經過修飾的核苷三磷酸，該修飾可以在反應初期阻止核苷酸摻入直至dNTP被熱激活，如此可極大地減少錯誤引發，避免引物二聚體形成以及其他可能的不良影響，從而在多重和快速PCR實驗中具有非常好的性能。CleanAmp™ PCR Kit試劑盒中提供CleanAmp™ dNTP，并包括已成功驗證過的DNA聚合酶。該試劑盒可以靈活地用于多種PCR檢測，包括快速和多重PCR。

Eppendorf realplex4 S real-time PCR系統使用超快的珀爾帖（Peltier）熱循環模塊，可以以6°C /秒的速度加熱并以4°C /秒的速度冷卻，在一小時內即可完成標準的40循環qPCR反應。珀爾帖模塊還可以確保溫度控制的精確性以及較高的模塊均質性，這對于高質量PCR反應至關重要。該系統的光學模塊是一個由96個LED 組成的陣列，這些LED可以預先選擇并均衡，以使它們可以均勻的激發所有樣本孔。這種設置消除使用其他常規qPCR儀器時，需要用ROX作為校正染料的必要性。Realplex4 S還使用了光電倍增管（PMT）進行信號檢測，這是目前可用的最,靈敏，最,經濟的檢測技術。

為了進一步探索CleanAmp™ PCR試劑盒和Eppendorf realplex4 S real-time PCR系統的優勢，本文的研究以這兩種技術的結合為特色，在30分鐘內完成可重復性的實時三重PCR的檢測。

方法

使用CleanAmp™的dNTP試劑盒與水解探針在realplex4 S real-time PCR系統上進行實時三重PCR檢測。使用CleanAmp™ PCR試劑盒擴增了三個小鼠基因組DNA靶標，分別為125、185和214個堿基對。實驗分兩組進行：首先，分別使用標準和快速PCR對三個靶標同時進行三重擴增（圖1）。其次，使用快速PCR對三個靶標進行同時擴增和單個擴增（圖2）。所有反應均在帶有Master clear™蓋條的Eppendorf實時PCR管條中通過使用水解探針進行檢測：125 bp（6-JOE; 0.2 µM），185 bp（FAM; 0.05 µM）和214 bp（ROX; 0.2 µM）。

首先，對標準和快速循環流程下的三重qPCR實驗進行了評估。所有反應均設置一式四份，并使用小鼠基因組DNA的5倍系列稀釋液為樣本，范圍從320 pg至1.0 µg。標準熱循環qPCR實驗的方案按照CleanAmp™ PCR試劑盒產品說明書中的“多重PCR方案" （1X PCR緩沖液（10 mM Tris-HCl（pH 8.3），50 mM KCl和2.5 mM MgCl2），0.4 mM CleanAmp™ dNTP，0.01 U / µL Taq DNA聚合酶和0.2 µM引物，25 µL）。在快速多重PCR實驗方案在上述方案的基礎上進行了以下改變：70 mM KCl，4.0 mM MgCl2，0.6 mM CleanAmp™ dNTP，0.33 U /μL U Taq DNA聚合酶，引物（125 bp和185 bp組為0.5 µM，214 bp引物組為0.7 µM）,15 µL)。

其次，在快速循環條件下進一步評估CleanAmp™ dNTP試劑盒，分別以單重和多重反應擴增三個相同的靶標。依然使用小鼠基因組DNA的5倍系列稀釋液為樣本，范圍從320 pg至200 ng，并設置三重復。快速循環條件和熱循環條件按照如上所述方案的進行。對于單重反應，遵循CleanAmp™ PCR Kit產品說明書中的“快速熱循環方案" （1x PCR緩沖液（10 mM Tris-HCl（pH 8.3），50 mM KCl和4.0 mM MgCl2），0.4 mM CleanAmp ™ dNTPs，0.33 U / µL Taq DNA聚合酶和0.5 µM引物，15 µL體系）。

結果與結論

對比標準和快速兩個條件下的三重 qPCR的結果顯示：兩者分別在1 h 26 min和24 min的熱循環時間內得到穩定的數據。在兩種反應條件下，擴增曲線間隔良好，重復緊密。R2值顯示標準曲線符合良好的線性，且不同靶標、不同檢測的擴增效率相當(Figure.1)。同樣在快速循環條件下分別進行的單指標和三重指標的擴增結果也類似：對于每個靶濃度，單指標和三重指標的擴增曲線重合，如圖2所示。因此，每個反應相似的Cq值反應了不同反應的擴增效率的一致性，如表(圖2B)所示。這些發現展示CleanAmp™ PCR試劑盒的多功能性和Mastercycler® ep realplex4 qPCR儀的速度，兩者相互補充，僅在24分鐘內就能獲得高效、可重復的三重qPCR數據。

CleanAmp™ PCR試劑盒和Mastercycler® ep realplex4 S qPCR儀的組合使我們能夠在保持與標準PCR或單指標PCR中可得到的高擴增效率的同時，實現快速三重qPCR.

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