信使核糖核酸（Messenger RNA，mRNA）技術開辟了疫苗學的新紀元。這篇綜述簡要介紹了mRNA疫苗的發展，以及mRNA與納米遞送系統產生的先天免疫反應。

The rise of mRNA vaccines

mRNA疫苗領域在新冠疫情中得到了快速發展，輝瑞/BioNTech 和Moderna分別研制的兩款mRNA新guan疫苗更首先獲得美國FDA的緊急使用授權1，使得mRNA疫苗受到大眾的廣泛關注。事實上，mRNA技術建立在多年的研究基礎之上，其概念驗證研究最早可以追溯到三十多年前，當時Wolff et al.注意到將裸mRNA注射到小鼠骨骼肌能夠在小鼠體內實現外源性蛋白的表達2。之后在1990年代的研究mRNA也被證明可以在體外和體內引發體液和細胞免疫反應3。不過，礙于mRNA本身結構不穩定，在體內應用后很容易降解，以及會誘發不必要的先天免疫反應3，mRNA技術有很長一段時間被認為其臨床應用性較低。隨著近十多年科學的進步，這些mRNA疫苗的研發難點逐漸被克服，例如通過進行化學修飾使mRNA增加穩定性和調節免疫原性、使用納米粒子技術提高mRNA的胞內表達和遞送效率等。其中，脂質納米顆粒（LNP）是當前最主流的mRNA疫苗的納米遞送系統。LNP-mRNA技術平臺現時已被廣泛應用在各種疾病（如癌癥、傳染病或遺傳疾病）的預防性疫苗或治療性疫苗的臨床前或臨床研究4。

Overcoming the innate immune responses

mRNA是由DNA作為模版轉錄而來、帶有蛋白質合成編碼信息的一類單鏈RNA（ssRNA）。合成mRNA可以通過體外轉錄酶促反應（in vitro transcription enzymatic reaction，IVT）產生3。不過，由于RNA具有天然的免疫刺激特性，在進入細胞時，外源的體外轉錄mRNA會被機體免疫防御系統的第一道防線識別，激活不同的模式識別受體（PRRs），例如位于內體的TLR7/85。而IVT制備過程除了產生目的產物mRNA本身外，還會產生各種副產物。其中主要的副產物雙鏈RNA（dsRNA）可以被TLR3和細胞質中的RIG-I/MDA-5特異性識別5。PRRs對RNA的感知會觸發信號轉導級聯反應，導致產生IFN-α和IFN-β等I型干擾素和促炎性細胞因子（見圖1）5。這些先天免疫激活可以有不良的影響，它們可以抑制mRNA的翻譯和蛋白抗原合成，甚至引發細胞死亡，最終降低mRNA疫苗的有效性。

為了克服這種先天免疫應答，Kariko? et al.首先嘗試化學修飾IVT mRNA，他們通過使用天然存在的假尿苷（Pseudouridine，Ψ）來替換RNA序列的尿苷堿基6。這種修飾模擬內源性mRNA，成功減少了mRNA與機體的TLR7/8和其他免疫傳感器的結合，限制I型IFN的過度產生并提高mRNA的翻譯能力6。除了Ψ，常用的mRNA修飾還有N1-甲基偽尿苷（N1-methylpseudouridine，m1ψ）。研究發現與ψ修飾相比，引入m1ψ的mRNA序列在增強蛋白表達的能力和逃脫機體天然免疫應答的表現更好，尤其是在減少TLR3激活反應方面7。此外，為了進一步避免不必要的先天免疫激活，從IVT mRNA中去除dsRNA雜質是非常重要。IVT mRNA的純化方法可以通過基于微珠的沉淀和色譜方法來實現，例如高效液相色譜（HPLC）4。

Formulating mRNA with LNPs

經修飾的mRNA轉錄物可以依靠LNP載體來保護其免于被細胞外的RNA酶（RNAse）降解，協助其順利進入細胞和內體逃逸3。不過，載體分子也可以與疫苗的免疫原性相關。LNP通常由不同比例的磷脂、膽固醇、可電離/陽離子脂質和PEG-脂質組成4。盡管磷脂和膽固醇作為天然的細胞膜成分不太可能觸發顯著的先天免疫應答，但一些可電離/陽離子脂質可以通過激活PRR通路誘導炎癥反應8。例如，Lonez et al.發現diC14-amidine脂質體可刺激TLR49；另一種陽離子脂質RPR206252也被發現可以通過TLR2和NLRP3通路激活炎癥反應10。此外，其他成分如PEG被指出可以激活補體系統，觸發機體的超敏反應。LNP遞送系統的設計依然需要持續優化，充分評估不同組件成分的炎癥性質，以調節與體內的先天免疫系統的相互作用。

Fig. 1: IVT mRNA and dsRNA byproducts-induced immune activation

Innate immune activation assessment

先天免疫感應機制對mRNA疫苗可能是一把“shuang刃劍"。如上文所述，它可能抑制蛋白表達或導致過度的炎癥反應；不過，預防性疫苗或某些類型的癌癥疫苗可能會受益于其佐劑效應12。例如有研究顯示輝瑞/BioNTech的新冠mRNA疫苗BNT162b2在小鼠體內通過MDA-5信號通路來誘導機體產生S蛋白特異性的CD8+ T細胞13，這種免疫反應可能有助提高疫苗效力的持久性。重要的是，mRNA疫苗的成分除了需要精心設計，也需要一個靈敏而強大的平臺來評估它們的免疫原性，以確定mRNA疫苗的初步安全性和有效性。InvivoGen提供了一系列的PRR報告細胞，可以幫助測試納米材料和mRNA制劑的免疫刺激特性，例如我們的HEK293衍生的TLR3和TLR7報告基因細胞被Coolen et al.用來比較兩種不同納米顆粒材料的mRNA疫苗的免疫激活14；Son et al.采用了InvivoGen的HEK293衍生的TLR4和TLR7報告基因細胞系來檢測不同mRNA納米載體在TLR信號通路的參與15（產品信息請參見下文）。

References

1.U.S. Food and Drug Administration, 2022. Regulatory information, FDA-2020-D-1137. 2.Wolff, J.A. et al. 1990. Science 1990, 247, 1465–1468. 3.Rosa, S.S. et al. 2021. Vaccine, 39(16), 2190-2200. 4.Hou, X. et al. 2021. Nat Rev Mater 6, 1078–1094 (2021). 5.Vlatkovic, I. et al. 2021. Biomedicines, 9(5), 530. 6.Karikó, K. et al. 2008. Molecular therapy, 16(11), 1833-1840. 7.Andries, O. et al. 2015. Journal of Controlled Release, 217, 337-344. 8.Igyártó, B.Z. et al. 2021. Current opinion in virology, 48, 65-72. 9.Lonez, C. et al. 2015. Cell Mol. Life Sci. 2015, 72, 3971–3982. 10.Lonez, C. et al. 2014. Nanomedicine 2014, 10, 775–782. 11.Kozma, G.T. et al. 2019. ACS Nano 2019, 13, 9315–9324. 12.Pardl, N. et al. 2018. Nature reviews Drug discovery, 17(4), 261-279. 13.Li, C. et al. 2022. Nature Immunology, 23(4), 543-555. 14.Coolen, A.L. et al. 2019. Biomaterials, 195, 23-37. 15.Son, S. et al. 2020. Nano letters, 20(3), 1499-1509.

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Fig 2: TLR Response Profile. HEK-Blue™ reporter cells were stimulated with 1/10 dilution of the sample solution provided and a fixed concentration of positive controls. After 24h incubation, TLR-induced NF-κB activation was assessed by measuring the SEAP levels in cell supernatants using QUANTI-Blue™.

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